当前位置:HOME > 医学文献 > 基础医学

白念珠菌对氟康唑耐药性的研究

发布时间 2015-08-21


关键字:  白念珠菌
  目前,临床致病菌的耐药问题是人类所面临的医学难题之一。近年来随着真菌感染患者的增多及抗真菌药物应用的频繁,真菌耐药现象也越来越普遍。最常见的致病真菌为白念珠菌,而白念珠菌耐氟康唑为最常见的真菌耐药现象[1]。在临床治疗同一艾滋病患者念珠菌性口炎时,所需氟康唑剂量需逐渐增大,菌的耐药水平也逐渐增大,而菌株并没有改变[2]。对耐药菌的出现,人们通常习惯认为是抗生素杀死了敏感菌,而将耐药的菌群亚株选出来,即耐药株是先天存在的,而非后天的适应性改变。较早涉及研究微生物是否有适应现象这个问题的是Luria和Delbrück;Cairns等[3]在1988年通过大肠杆菌Lac-株利用乳糖的漂移试验,提出了适应性突变理论。本实验就目前临床最常见的真菌耐药现象――白念珠菌对氟康唑耐药性的来源作一初步研究。
  1 材料和方法
  1.1 材料 白念珠菌Y0109株,为标准敏感野生株,对氟康唑敏感,用NCCLS(the National Committee for Clinical Laboratory Standards)方法测得耐药值小于0.5 μg/ml;白念珠菌Y0119株,为标准耐药株,对氟康唑耐药,用NCCLS方法测得耐药值大于32.0 μg/ml;以上菌株均由中国医学科学院皮肤病防治研究所提供。氟康唑粉剂由第二军医大学药学院有机化学教研室提供,用生理盐水溶解制成800 μg/ml母液备用。培养基选用不含任何药物的沙堡液体培养基和沙堡固体培养基(即空白培养基),及含氟康唑8 μg/ml的沙堡固体培养基。
  1.2 方法
  1.2.1 原理 根据Cairns所述理论[3],如白念珠菌敏感株Y0109株在含药培养皿上长出的耐药株只是其中先天就耐受氟康唑的亚株,则其在数个同样培养皿中生长出的耐药菌落数目应符合Delbrück曲线分布特点。 如在含药平皿上长出的耐药菌落全为后天适应性突变而产生耐药的,则长出的菌落数目分布应符合Poisson曲线分布特点。如与先天遗传及和后天适应性突变均有关,则为两者复合图形。
  1.2.2 Y0109株氟康唑诱导培养及菌落计数 将Y0109株在空白固体沙堡培养基上培养24 h后,挑取1个单菌落(以保证菌为单克隆菌),用注射用水制成混悬液后,平均分至11个含10 ml液体沙堡培养基大试管中,培养48 h,检测菌浓增殖到(2~3)×107 cfu/ml时 ,用振荡器将其振荡15 min摇匀,每管涂10个平皿,每个平皿用0.5 ml(每个平皿中含10 ml固体沙堡培养基,含氟康唑浓度为8 μg/ml),第11号管为空白固体沙堡培养基对照。给每个平皿编号。每隔24 h计数所能观察到的新生菌落数,共观察10 d,直至没有新生菌落产生。共涂布培养皿112个(包括第11只管只涂2个空白培养基作对照)。
  1.2.3 各株菌在无药情况下生成菌落的速度 将敏感菌株Y0109株、标准耐药株Y0119株及诱导出的耐药株分别在不同试验室用无菌生理盐水稀释,连续振荡15 min,制成均匀混悬液,菌量调至(2~3)×104 cfu/ml,均用0.5 ml菌液涂布空白固体沙堡培养基上,每组10个平皿,各组取平均值。
  1.2.4 各株菌在氟康唑固体沙堡培养基上菌落生成速度 除培养基由空白换成含氟康唑8 μg/ml外,余材料及操作同上。
  1.2.5 敏感菌株中先天耐药菌数目检测 用含菌4×107 cfu/ml的Y0109株菌混悬液(制备方法同上)0.5 ml涂布到含氟康唑8 μg/ml固体沙堡培养基上,共10个平皿,观察24 h。用临床耐药株Y0109株做如上操作作为对照(在不同实验室)。
  1.2.6 在含药8 μg/ml固体沙堡培养基白念珠菌的活力保持 绝大多数白念珠菌不能发生突变而长不成菌落,但仍有活力。第10天时,在培养皿(注意保持湿度,在100个含药诱导培养平皿中随机选择10个)没有长出菌落的部位盲涂转种到2个空白培养基上,并同时转种1个含药培养基(含氟康唑8μg/ml)作对照。
  2 结 果
  2.1 标准敏感株诱导培养后菌落数 在诱导培养过程中,空白对照平皿24 h后菌落就已密布平皿,含药的平皿在72 h后才出现单个菌落。观察7 d后才无新的可见菌落生成。在100个含药平皿中,平均每个平皿长出的耐药菌落数目为m=52.35(16~157)。以10 为组距,分组后统计各组的频数,取各组上下限的均数计算频数及相应均数的常用对数值,参照Cairns的理论图形格式进行绘图(图1,曲线a)。
  根据Cairns理论,在m=52.35'n=100情况下,利用公式P(X)=e-μμx/X!' P(X)其中为发生X次突变的理论频数'e为自然底数,μ为总体均数(实际运算中以平均突变数m代替),X!代表X的阶乘,其推导出的Poisson曲线为曲线b。
  根据Delbrück的自由突变理论及公式Pr=Cj're-mmj/j![2]推导出的图形为曲线c。Pr为发生r次突变的概率,Cj'r为应该发生j次突变而实际发生了r次突变的样本数,m为实际发生突变的均数。
  从图1曲线a与b图形形状看,具有近似性;而与图中 Delbrück曲线c图形相差甚远。由此可以推论:白念珠菌对氟康唑耐药主要是因后天氟康唑诱导作用,即主要是因为白念珠菌对氟康唑的抑制作用发生了适应性突变所致。但曲线a仍有少许拖尾现象,即这个图形是一个复合图形,故考虑不排除先天耐药成分,即自然突变导致耐药成分的存在。
  2.2 耐药菌与敏感株菌在空白沙堡培养基菌落生成速度比较 各菌株观察时间、计数。
  以上数据经过如下修正:各数据除以相应的初始接种浓度,以校正因接种浓度不同所引起的误差。结果经方差分析两两比较检验,证明无显著差异,即各菌株生成菌落数目无差异;因观察时间相同,故考虑各菌株菌落生成速度也无显著差异(不包括敏感菌对照资料)。
  2.3 敏感株中先天耐药菌比例 将 4×107 cfu/ml Y0109株菌0.5 ml接种到含氟康唑8 μg/ml固体沙堡培养基上,共10个平皿,观察24 h,未见明显菌落,在72 h后渐出现菌落。而用临床耐药菌Y0119株所做的10个对照平皿在12 h即有菌落出现,24 h后就密布平皿。
  2.4 含药平皿上敏感菌活力保持时间 在转种的20个空白培养基中,经24 h后均长出菌落,而10个含药对照平皿培养7 d后仍未见有菌落形成。
  3 讨 论
  本实验在标准敏感株诱导培养计数菌落过程中,只发现有3个较大菌落,且出现在培养72 h后;没有发现在早期同时出现多个菌落的组。用耐药菌所做的对照显示,耐药菌在含药平皿上与敏感菌在空白平皿上生成菌落的速度具有一致性,也产生大小类似的菌落;即使耐药株经过了空白平皿的培养传代,这一性质也不会改变。事实上,我们将诱导出的耐药菌与敏感菌做这一对照试验时也验证了这一点。另外,如实验所示用0.5 ml 107 cfu/ml敏感菌菌量,在8 μg/ml平皿上培养24 h并无可见菌落出现,而用白念珠菌耐药株Y0119株在含有相同浓度药物的平皿上所做的对照,生长出的菌落在24 h内已经密布平皿,这说明在敏感株中因自然突变而导致的耐药性是很低的。
  如是在接触药物后发生的突变,即药物诱导出来的突变,则由于诱导培养环境相似,则各培养皿长出的耐药菌落在时间、大小、数目上应有近似性。正如图1所示,图形属于Poisson 和Delbrück这两种曲线的合并,但主要以Poisson图形为主。也就是说,耐药株的产生以后天诱导为主。这就从理论上初步验证了诱导耐药现象的存在,即耐药的出现与菌对药物的适应性突变有重要关系;白念珠菌在氟康唑的药物作用下会发生适应性突变,导致耐药。
  根据所接种的菌量(约为1.2×107 cfu)与平均产生的突变菌落数(约为50个),加之在固体平板上,且产生的菌落相距较远,故可基本排除接触药物后会有“互饲”及耐药基因的传递而影响实验结果,即一个耐药菌落就代表一个敏感菌(及其所长出而未脱落的芽)突变成耐药菌。
  在含药的诱导培养基上,只要是耐药菌,药物并不能影响其菌落形成速度;即先天耐药菌不会因迟滞生长而与诱导出的耐药菌相混同,也不会因生长迟缓而引起计数误差。
  氟康唑在沙堡培养基中浓度为8 μg/ml时只是抑菌'即使是敏感菌也可在其上存活较长时间(大于10 d);白念珠菌在被抑制的环境中发生了适应性突变。因此,测菌的MIC必须用标准统一的方案。
  根据本实验数据所绘制的曲线与Poisson曲线有差异,除不能排除自然突变因素外,还可能有以下因素:(1)计数菌落误差,对个别较小菌落有漏计或重计;(2)接种量误差,此有待统计学校正;(3)菌自然凋亡而不能生成菌落。
  总之,本实验可以为临床医生正确使用抗生素提供理论依据,从而确认所谓“小剂量预防用药”是错误的,提示滥用抗生素是极其危险的――极有可能给人类带来耐药菌。

 

相关内容
  • 白念珠菌对氟康唑耐药性的研究 2015-08-21
  • 关于我们 | 付款方式 | 联系我们 | 常见问题 | 广告服务 | 期刊鉴别 | 免责申明 | 发表流程 | 下载中心 在线投稿
    关键词:中华医学期刊网 中华医学期刊编辑部 医学期刊网 医药卫生期刊网 医药卫生发表 医疗卫生期刊网 医学杂志网 中华医学期刊
    Copyright © 2005 - 2018  www.zhyxqk.com  中华医学期刊网  版权所有  支持单位:北京瀚海星云国际文化传媒中心
    电话010-86398766 投稿邮箱:zhyxqk@163.com 请注明投稿杂志名称    1303927712 
    1303927712  1550986550 1550986550 

    经营性网站备案信息  中国电子商务诚信单位 网站信用良好 网络110报警服务 网站信用良好 网络110报警服务


    网站管理