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0Wnt5a基因在血液病及白血病细胞株中的表达

发布时间 2015-08-21



【摘要】  本研究观察Wnt5a在部分血液病及白血病细胞株中的表达情况,为进一步研究Wnt5a在血液肿瘤中的作用及其机制打下基础。 用人淋巴细胞分离液分离外周血和骨髓单个核细胞,以RTPCR检测31例病例标本及3种白血病细胞株中Wnt5a的表达。结果表明: 5例AML中4例均为阴性或弱阳性,仅1例完全缓解的病例表达呈强阳性。K562、HL60细胞的Wnt5a表达也为阴性,Jurkat细胞的Wnt5a表达阳性。6例CML的Wnt5a表达均为阴性。4例ALL中3例为表达阳性或弱阳性,1例表达为阴性;2例CLL为阴性表达;2例MM中Wnt5a表达1例为弱阳性,1例为阴性;3例淋巴瘤中有1例为弱阳性,2例为阴性;2例AA、2例IDA、3例ITP、1例ET及PV Wnt5a表达均为阳性或弱阳性。结论:在31例血液病标本及髓系白血病细胞株中,除ALL外,有明显的Wnt5a表达缺失或降低,而非恶性血液病例中Wnt5a表达普遍呈阳性,提示Wnt5a的表达下调可能与髓系白血病的发生有关。

【关键词】  白血病细胞株

     Expression of Wnt5a Gene in Hematologic Diseases and Leukemic Cell Lines

    LI ZhaoQuan,  SI WeiKe,PAN Jing,  YUAN Yuan, ZOU QuanMing

    Department of Clinic Hematology, The Third Military Medical University, PLA, Chongqing, 400038, China

    Abstract    This  study was aimed to investigate the expression level  of Wnt5a gene in some hematologic diseases and leukemic cell lines so as to provide a basis for further research of Wnt5a role and  its mechanism in hematologic malignancies.   The mononuclear cells of peripheral blood and bone marrow were isolated by human lymphocytic isolation solution. The expression of Wnt5a gene  in specimen of 31 cases and three leukemic cell lines  (Jurkat, K562, HL60)were detected by RTPCR. The  results showed that in  four out of five AML cases, negative or weak positive expressions  were observed and  negative expressions were observed also  in K562 and HL60 cells. Only in  one AML case with complete remission and  Jurkat cells the strong positive expressions were observed. The negative expression was observed in  all six CML cases. In   three out  of four ALL cases, the expression  was positive or weak positive  and one negative. The  expressions in two CLL cases were negative. Out of  two MM cases, the expression in one  was weak positive and in  other was negative. Out  of  three lymphoma cases, the expression in  one case was weak positive and in other two cases were negative. There were positive or weak positive expressions in   two cases of AA, two cases of IDA, three cases of  ITP, one cases of PV and ET cases. It is concluded that   there have obvious downregulated or lost expression of Wnt5a gene in 31 cases of  hematologic disease      and myelocytic leukemic cell lines except   ALL samples. Nevertheless there have general positive expression of Wnt5a in cases of  nonmalignant hematologic diseases. These results suggest that the genesis of myelocytic leukemia  is related to the downregulated expression of Wnt5a.

    Key words    Wnt5a; hematologic diseases; leukemic cell line;gene expression

    J Exp Hematol 2007; 15(5):927-930

    Wnt蛋白家族是一组富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白信号分子,至今已有19个Wnt蛋白分子在哺乳动物中被鉴定出来。它们与个体发育、细胞增殖、分化调控,甚至肿瘤发生密切相关[1]。Wnt5a基因是Wnt家族重要成员之一,被认为具有癌基因潜质,如在泌尿肿瘤细胞系中有异常高表达[2]。但也有研究显示,Wnt5a基因可能是一种抑癌基因,抑制B细胞增殖,其表达缺失可导致慢性髓系白血病[3]。目前尚无关于Wnt5a基因在血液病中表达的详细报道,其在血液肿瘤中的作用不明,值得深入研究。为此,我们用RTPCR方法检测了31例血液病患者标本及3种白血病细胞株中的Wnt5a基因的表达情况,为进一步研究Wnt5a在血液肿瘤中的作用及其机制打下基础。

    材料和方法

    标本源自我校附属西南医院血液科和新桥医院血液科。2006年9-12月共收集31例血液病患者外周血(PB)或骨髓(BM)标本,其中AML 5例, CML 6例,ALL 4例,CLL 2例,淋巴瘤3例,MM 2例,IDA 2例,ITP 3例,AA 2例,PV 1例,ET 1例。全部病例均根据临床特征、形态学、免疫学表型,血象和骨髓象及细胞化学染色确诊。31例病人中男18例,女13例,年龄11-69岁,平均年龄42.4岁。在31份标本中骨髓标本14例,外周血标本17例。

    细胞株 

    急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat,人红白血病细胞株K562和急性早幼粒细胞白血病细胞株HL60均为我室保存细胞株。

    主要仪器及试剂 

    PCR扩增仪(BIORAD产品),电泳仪(北京六一厂产品),凝胶成像分析仪(北京六一厂产品),CO2培养箱(Thermo Forma公司产品),紫外可见分光光度仪(北京普析公司产品);RPM 1640培养基(Gibco产品),小牛血清(杭州四季青生物材料研究所产品),Tripure RNA分离试剂(Roche产品),RTPCR试剂盒(Toyobo公司产品),Wnt5a引物由美国芝加哥大学医学中心分子肿瘤学研究室TCHe主任惠赠。

    标本取材及处理 

    标本单个核细胞分离参考王艳等[4]的方法进行。静脉穿刺取病人外周血2 ml,肝素钠抗凝,骨髓穿刺取病人骨髓2 ml,肝素钠抗凝;用PBS 1∶1 稀释,沿管壁小心加于2 ml人淋巴细胞分离液上,以726×g离心15分钟,吸取白色分界层细胞,加适量PBS以412×g离心10分钟,洗涤2次。

    细胞培养 

    置Jurkat、K562、HL60细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中,于37 ℃、5% CO2条件下培养备用。

    Wnt5a基因表达的RTPCR检测

    从病例标本分离细胞,在培养细胞株中取(5-10)×106个细胞,采用Tripure RNA分离试剂提取细胞总RNA,测定总RNA OD260/280比值并计算其浓度;参照RTPCR试剂盒说明书加入1 μg总RNA建立20μl RT反应体系;PCR扩增建立总体积为25μl的反应体系,Wnt5a上游引物:5′TGTGGTTTAATG GTGCCTGA3′;Wnt5a 下游引物:5′TTCGTCGTG CTCAAGGTATG3′,扩增产物大小为253 bp,内参照GAPDH 上游引物:5′CATCACCATCTTCCAGG AGCG3′,GAPDH下游引物:5′TGACCTTGCCCA CAGCCTTG3′,产物大小为443 bp,扩增条件为94℃变性5分钟,94℃、56.5℃、72℃各45秒,循环35次,72℃孵育7分钟;最后取20 μl扩增产物进行1.6%琼脂糖凝胶电泳并照相及图像处理。

    结    果

    AML细胞及K562和HL60细胞株中的Wnt5a表达

    AML细胞及K562、HL60 Wnt5a表达见图1。5例AML中有2例Wnt5a基因表达呈弱阳性(泳道2、3,均为外周血标本),2例表达阴性(泳道5、6,外周血与骨髓标本各1例),有1例是经化疗后完全缓解(CR)病例(泳道4,为外周血标本)Wnt5a表达呈强阳性。K562细胞及HL60细胞 Wnt5a均呈阴性表达(泳道7,8)。

    Figure 1. Expression of Wnt5a gene in AML cells and leukemia cell lines. M:DNA marker 2000.   Lane 1:Jurkat cells.   Lane 2,3,5:AML(PB).   Lane 4:AMLCR(PB). Lane 6:AML(BM).   Lane 7:K562 cell.   Lane 8:HL60 cells.   Line 9:negative control without cDNA.

    CML细胞的Wnt5a表达

    CML细胞Wnt5a表达见图2。6例CML标本Wnt5a均呈阴性表达,外周血与骨髓标本各3例,未见表达差异。

    ALL和CLL细胞的Wnt5a表达

    ALL及CLL细胞Wnt5a表达见图3。4例ALL均为外周血标本,1例呈强阳性表达(泳道2),2例呈弱阳性表达(泳道 3、4),1例呈阴性表达(泳道5);2例CLL外周血标本Wnt5a呈阴性表达(泳道6、7)。Figure 2. Expression of Wnt5a gene in CML cells.  M:DNA marker 2000.  Lane 1:Jurkat cells.   Lane 2-4:CML(PB). Lane 5-7:CML(BM).  Lane 8:negative control without cDNA.

    Figure 3. Expression of Wnt5a gene in ALL and CLL cells.  M:DNA marker 2000.  Lane 1:Jurkat cells.  Lane 2-5:ALL(PB). Lane 6-7:CLL(PB).   Lane 8:negative control without cDNA.

    MM和淋巴瘤细胞中的Wnt5a表达

    MM及淋巴瘤细胞中Wnt5a表达见图4。2例MM标本中,1例为骨髓标本呈弱阳性表达(泳道2),1例外周血标本呈阴性表达(泳道 3);3例淋巴瘤标本中,1例为骨髓标本呈弱阳性表达(泳道4),2例外周血标本呈阴性表达(泳道5、6)。

    Figure 4. Expression of Wnt5a gene in MM and Lymphoma cells. M:DNA marker 2000.   Lane 1:Jurkat cells.  Lane 2:MM(BM).   Lane 3:MM(PB). Lane 4:lymphoma(BM).   Lane 5-6:lymphoma(PB).   Lane 7:negative control without cDNA.

    其他血液病细胞中的Wnt5a表达

    其他血液病细胞中Wnt5a表达见图5。2例再生障碍性贫血(AA)病例标本中,1例为外周血(泳道2),Wnt5a呈阴性表达,1例为骨髓(泳道3),Wnt5a呈阳性表达;2例缺铁性贫血(IDA)病例标本均为骨髓(泳道4、5),Wnt5a呈阳性表达;3例原发性血小板减少性紫癜(ITP)病例标本均为骨髓(泳道6-8),Wnt5a均呈阳性表达;原发性血小板增多症及真性红细胞增多症各1例,均为骨髓标本,Wnt5a均呈阳性表达(泳道9、10)。

    Figure 5. Expression of Wnt5a gene in other hematologic diseases. M:DNA marker 2000.  Lane 1:Jurkat cells.  Lane 2:AA(PB).  Lane 3:AA(BM).   Lane  4-5:IDA(BM).  Lane 6-8:ITP(BM).   Lane 9:ET(BM).   Lane 10:PV(BM).   Lane 11:negative control without cDNA. 讨    论

    Wnt基因广泛表达于多种组织,且具有高度的保守性,从低等生物果蝇到高等哺乳动物均具有高度的同源性。Wnt基因编码产物所介导的信号转导通路,即经典Wnt/βcatenin途径,不仅在胚胎发育中调节细胞的增殖、分化、迁移、极性和死亡,并且与恶性肿瘤的发生、发展密切相关[1]。一般来讲,Wnt信号不表达于正常成熟细胞中,而表达于早期细胞如干、祖细胞或肿瘤细胞中[5]。

    据文献调查,Wnt家族中,与造血系统关系密切的主要有Wnt1、Wnt2b、Wnt3a、Wnt5a及Wnt10b等[6,7]。Wnt5a是Wnt家族中重要的一员,在早期造血细胞有普遍表达,如CD34+Lin-细胞[5]。据研究资料显示,它可促进造血干/祖细胞的更新与增殖,在某些恶性肿瘤细胞中,如鳞状上皮肿瘤细胞、恶性成纤维细胞、胃癌细胞等Wnt5a出现异常高表达[8-10]。因此,Wnt5a基因高表达可能与这些肿瘤发生相关,是一种癌基因,但也有些研究显示,Wnt5a也可能是一种抑癌基因,在某些肿瘤组织中表达缺失[3]。为了研究Wnt5a在血液肿瘤中的作用,据文献报道,急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat中Wnt5a基因呈强阳性表达[5]。我们以Jurkat细胞为Wnt5a表达阳性对照,监测了31例各类血液病及3种白血病细胞株中Wnt5a的表达情况,发现Wnt5a一些有意义的表达结果。

    首先,在髓系白血病中,我们发现Wnt5a表达普遍较低。5例AML中,除1例完全缓解病例表达高外,其余4例均为弱阳性或阴性表达,而6例CML病例均未检测到Wnt5a表达,髓系白血病细胞株K562及HL60也没有检测到Wnt5a表达,因此Wnt5a的低表达或表达缺失与髓系白血病的发生可能相关,Wnt5a可能在髓系白血病中扮演抑癌基因角色,因此表达降低;1例完全缓解的AML病例Wnt5a高表达,它从另一个角度说明Wnt5a在髓系白血病中的作用,由于这样的病例太少,对此还有待增加相关病例进一步研究证明。

    其次,在淋巴细胞白血病中,Wnt5a表达阳性率高于髓系白血病。4例ALL中有3例检测到Wnt5a表达,而急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat细胞也有高表达,说明在T淋巴细胞白血病Wnt5a不是发挥抑癌基因的作用。2例CLL病例中,Wnt5a均表达缺失,这与文献报道比较符合,也可能是因为CLL多为成熟B淋巴细胞,因此未见Wnt5a表达。2例多发性骨髓瘤及3例淋巴瘤病例中,Wnt5a的表达均较低,可能与其发病相关。

    再者,非恶性血液病Wnt5a普遍呈阳性表达。在检测的9例非恶性血液病中,除少数为弱阳性表达外,其余均为阳性表达,这与正常造血组织细胞普遍表达Wnt5a的报道类似,说明非恶性血液疾病的发生与Wnt5a表达关系不大。

    在我们的检测实验中所收集的病例标本有外周血和骨髓标本,两种不同标本对检测结果有一定程度影响,由于Wnt5a普遍在早期细胞或某些肿瘤细胞表达,外周血早期细胞较骨髓少,因此某些病例骨髓标本Wnt5a表达较外周血标本强,如AA、MM、淋巴瘤的病例标本,但在白血病标本没有发现这样的区别。

    归纳我们实验及文献资料[5,6,11],Wnt信号通路在血液系统疾病的发生发展中有重要作用。Wnt5a普遍在造血组织和早期造血细胞中表达,我们发现在髓系白血病中表达降低或缺失,在急性T淋巴细胞白血病中表达高,在慢性B淋巴细胞白血病表达缺失,淋巴瘤、多发性骨髓瘤有表达降低的表现。因此,在恶性血液系统疾病中,除急性T淋巴细胞白血病外,Wnt5a均表达降低或缺失,而在非恶性血液病中有普遍表达。

    为何Wnt5a在不同血液病中的表达有如此差异?这可能与它在不同血液病中的作用角色不同,它可能是癌基因,也可能是抑癌基因。有研究表明,Wnt5a可通过Wnt/Ca2+途径[12],既可以激活也可以抑制经典的Wnt/βcatenin途径,这取决于哪一种受体组合表达于细胞表面。当Wnt5a与酪氨酸激酶样孤独受体(Ror2)相互作用时,经典通路中的Wnt/βcatenin途径就会被抑制,而当Wnt5a与Frizzled和低密度脂蛋白受体相关跨膜蛋白(LRP)结合时,βcatenin途径就被激活[13]。Wnt5a在不同血液病中的不同作用可能与此相关,其确切的作用机制值得深入研究。

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